云南小麦(Triticum aestivum subsp. yunnanense, 2n=6x=42, AABBDD)成熟时有在外力影响下穗轴易折断的原始特点，是分布在云南省澜沧江和怒江两岸、高海拔山区(董玉琛等, 1981; 伍少云和奉有壁, 2001; 杨木军和伍少云, 2005, 云南科技出版社, pp.457-636)的中国特有普通小麦亚种。其穗轴折断方式是和西藏小麦(T. aestivum subsp. tibetanum)及马卡小麦(T. aestivum subsp. macha)的方式相同的，即都是发生下节位(杨木军和伍少云, 2005, 云南科技出版社, pp.457-636; 曾学琦等, 1989, 云南农业科技, (5): 3-6)或楔型(陈庆富, 1999; 王志清和郑有良, 2004)断裂。这种折断方式的断点发生在小穗与主穗轴连接处的上方(陈庆富, 1999)，而断裂后的小穗是与自己的小穗轴相粘连的。但是和西藏小麦不同的是，云南小麦成熟时只在受到外力作用时才会发生穗轴断裂(董玉琛等, 1981; 杨木军和伍少云, 2005, 云南科技出版社, pp.457-636; 曾学琦等, 1989, 云南农业科技, (5): 3-6)，而西藏小麦的穗则是自然脱落(邵启全等, 1980; 陆平, 2000, 西藏农业科技, 22(2): 23-27)。

云南小麦、西藏小麦、马卡小麦和斯卑尔脱小麦(T. aestivum subsp. spelta)等栽培六倍体小麦成熟时表现出的穗轴折断特点是其野生祖先乌拉尔图小麦(T. urartu)、野生二粒小麦(T. turgiduum subsp. dicoccoides)和粗山羊草(T. tauschii)的野生特性延续，这种特性对研究普通小麦的起源、演化及同祖先的亲缘关系有重要意义。Chen等(1998)利用中国春单体和双端体最先将西藏小麦AS9053的断穗基因定位在染色体3DS上，并命名为Br1。宋星(宋星, 2006, 中国农业大学, pp.1-42)和Watanabe等(2005)随后筛选到了和西藏小麦西藏1817、KU510的断穗基因有关联的2对SSR引物，即GDM8和GDM72，并分别建立了着丝点-xgdm8 (45.8 cM)-xgdm72 (29.1 cM)-Br1和着丝点-xgdm8 (37.2 cM)-xgdm72 (23.6 cM)-Br1的关系。后者还从粗山羊草KU2126 (普通小麦的二倍体祖先)、野生二粒小麦(T. turgiduum subsp. dicoccoides, DIC; 普通小麦的四倍体祖先)、硬粒小麦Langdon的代换系(LDN)-DIC 3A和LDN-DIC 3B和普通小麦-粗山羊草渗入系R-61中筛选到了断穗基因的相关SSR引物，同时建立引物位点与基因之间的联系。其中KU2126和R-61的断穗基因Br^t和Br⁶¹被定位在3DS上，与SSR引物位点的关系分别是着丝点-xgd-m8 (26.6 cM)-xgdm72 (19.7 cM)-Br^t-xgwm183 (41.1 cM)和着丝点-xgwm661 (74.5 cM)-xgdm8 (29.4 cM)-xgdm72 (27.5 cM)-Br⁶¹-xgwm2 (28.3 cM)-xgwm161 (40.1 cM)；代换系LDN-DIC 3A和LDN-DIC 3B的断穗基因Br2和Br3被分别定位在3AS和3BS上，二者与SSR位点的关系分别为着丝点-xgwm5 (19 cM)-xgwm32 (13.3 cM)-Br2-xgwm779和着丝点-xgwm72 (14.2 cM)-Br3-xgwm685 (32.8 cM)。

尽管云南小麦与西藏和马卡小麦有相同的断穗方式，但是至今尚未对其断穗基因进行定位研究。因此，尚不清楚其断穗基因的来源以及是否和西藏小麦的断穗基因相同。所以，本研究试图用前人已筛选到的和小麦断穗基因有联系的SSR引物，探讨其和稀有小麦种，特别是和粗山羊、野生二粒小麦两个普通栽培小麦的祖先之间的遗传关系，并尝试通过引物与基因、以及云南小麦和中国春之间的关系，找到它和西藏小麦之间可能存在的一些分子生物学上的联系，为对其断穗基因定位研究奠定基础。

1结果与分析
1.1云南小麦亚种被扩增出的多态性片段差异
包括37份云南小麦在内的47份参试材料被8对SSR引物扩增出了490条多态性片段，平均每个SSR引物扩增出61.25条(表1)。其中，云南小麦被扩增出了387条多态性片段，每对引物平均检测到48.375条。但是，镇康顶芒铁壳麦(1) (云0026)未被引物WMS2、双江长芒铁壳麦(云0017)未被引物GDM72 (图1)、永德短芒铁壳麦(云0027)未被引物WMS183扩增出产物；双江长芒铁壳麦(云0016)、云县无芒硬壳麦(云0027)、镇康顶芒铁壳麦(1)、云县铁壳麦(云0022)、云县铁壳麦(2) (云0023)、澜沧铁壳麦(云0607)和双江铁壳麦(云0612)等7份没有引物WMS72的产物(图2)。这说明云南小麦亚种不同品种间的遗传多样性可能有所差异。除镇康铁壳麦(1) (云0028)外，云南小麦被引物WMS32 (图3)扩增出的片段位置都低于野生二粒小麦的片段位置，被引物WMS72扩增到的多态性片段大多和野生二粒小麦的不同(图2)。这种差异说明，云南小麦的断穗基因可能和Watanabe等(2005)定位在野生二粒小麦3AS和3BS上的Br2和Br3不同。

表1 与断穗基因相关的SSR引物对参试材料的扩增结果及位点的多态性信息含量(PIC)和Shannon多样性指数(I) Table 1 The amplification results of SSR primers related to brittle rachis gene and PIC and Shannon's diversity index (I) of locus in 47 accessions

图1 SSR引物GDM72对参试材的扩增结果 注: M: DL2000 marker; 1~47: 为47份参试材料的序号(表2) Figure 1 Result of experiment materials were amplified by SSR primer GDM72 Note: M: DL2000 marker; 1~47: The number of 47 accessions materials (table 2)

图2 引物WMS72对参试材料的扩增结果 注: M: DL2000 marker; 1~47: 为47份参试材料的序号(表2) Figure 2 Result of experiment materials were amplified by SSR primer WMS72 Note: M: DL2000 marker; 1~47: The number of 47 accessions materials (table 2)

图3 引物WMS32对实验材料的扩增结果 注: M: DL2000 marker; 1~47: 为47份参试材料的序号(表2) Figure 3 Result of experiment materials were amplified by SSR primer WMS32 Note: M: DL2000 marker; 1~47: The number of 47 accessions materials (table 2)

1.2不同种或亚种间的多态信息含量和多样性指数差异
以材料总数为计算单元的每个SSR位点的多态性信息含量(PIC)和多样性指数(I)分别在0.250 4~ 0.902 7和0.500 6~2.636 3之间，平均为0.681 0和1.606 0。其中，云南小麦的PIC在0.148 2~0.891 8之间。 

按PIC<0.25为低度、介于0.25和0.5之间为中度、大于0.5为高度的多态性判断标准(魏会廷等, 2008,自然科学进展, 18(9): 987-993)，5个种8个亚种间的多态性信息含量有很大的差异。粗山羊草种的2份材料在xgwm72-3BS和xgwm183-3DS位点没有多态性(PIC=0)，而在xgwm5-3AS、xgwm72-3BS和xgwm2-3DS等6个位点有中度到高度的多态性(PIC= 0.444 4~0.666 7)；一粒系小麦(包含乌拉尔图小麦种, 野生和栽培一粒小麦亚种)的3份材料在xgw-m5-3AS、xgwm32-3AS、xgwm2-3DS和xgwm8-3DS 4位点有中、高度的多态性(PIC=0.375 0~0.666 7)，但是在xgwm72-3BS、xgwm72-3DS、xgwm161-3DS和xgwm183-3DS 4个位点无多态性；圆锥小麦种(即二粒系小麦, 包括野生二粒小麦, 东方小麦, 波兰小麦和波斯小麦4个亚种)的4份材料在xgwm5-3AS、xgwm32-3AS、xgwm72-3BS、xgwm2-3DS和xgwm8-3DS 5个SSR位点上都表现出了较高的多态性水平(PIC=0.375 0~0.693 9)，但是在xgdm72-3DS、xgwm-161-3DS和xgwm183-3DS3位点则无多态性；而普通小麦亚种中国春只在xgwm5-3AS、xgwm2-3DS和xgwm8-3DS 3个位点上有高度多态性(PIC=0.5)；除xgwm183-3DS位点外，云南小麦在xgwm5-3AS、xg- wm32-3AS和xgwm72-3BS等7位点都有高度的多态性(PIC=0.526 5~0.891 8)。

从判断多样性高低的另一个指标、Shannon多样性指数(I)看(表1)，以参试材料总数为计算单元时，参试材在xgwm5-3AS、xgwm32-3AS、xgwm72-3BS、xgwm2-3DS和xgdm72-3DS等5个SSR位点都有较高的遗传多样性(I=1.457 7~2.636 3)，占位点总数的62.5%。但是，不同种或亚种的遗传多样性也有明显差异。2份粗山羊草在xgwm72-3BS和xgwm183- 3DS位点无多样性(I=0)，在xgwm5-3AS、xgwm32-3AS、xgwm2-3DS、xgwm8-3DS、xgdm72-3DS和xg-wm161-3DS 6个位点的多样性也很低(I=0.636 5~1.098 6)；一粒系小麦、二粒系小麦和中国春的遗传多样性水平也较低(I=0.562 3~1.2770)；云南小麦在xg- wm32-3AS、xgwm72-3BS、xgwm2-3DS和xgdm72-3DS等4个位点上都有丰富的遗传多样性(I=1.609 7~2.496 1)。

1.3云南小麦和4个稀有小麦种的遗传聚类分析
根据NTSYS PC-2.1e软件按UPGMA方法构建的遗传聚类树形图(图4)，47份材料被分成两大类群。第一类只包括分别来自陕西和中东地区的粗山羊草，表明普通小麦亚种中国春、云南小麦亚种和这2份粗山羊草的亲缘关系较远，它们的D基因组不太可能是这2份粗山羊草提供的。第二类包括了除粗山羊草外的全部45份材料，但是可被再分为3个亚类。第一亚类包含一粒系和二粒系小麦的7份材料及1份云南小麦(凤庆铁壳麦, 云0020, XM0907)，说明这8份材料之间有非常近的亲缘关系。其中，野生和栽培一粒小麦被首先聚在一起，其后才和乌拉尔图小麦相聚，表明前二者之间有较后者更近的遗传关系，证明栽培一粒小麦的确起源于野生一粒小麦；圆锥小麦种中波兰小麦亚种和波斯小麦亚种被划分在一起，并首先和一粒系小麦聚成类，而野生二粒小麦亚种和东方小麦亚种被首先单独分在一起，然后再和波兰小麦、波斯小麦及一粒系小麦聚类。这说明同为圆锥小麦种的波兰小麦、波斯小麦和东方小麦的起源与演化可能有一定差异，前两者可能有最近的共同祖先，而东方小麦可能是由野生二粒小麦演化而来的。第二亚类只包含1份云南小麦，即镇康铁壳麦(1) (云0028, ZM08792)。第三亚类则含盖了除镇康铁壳麦(1)和凤庆铁壳麦(云0020, XM0907)外的35份云南小麦和中国春小麦。该亚类可再分3组，中国春、腾冲铁壳麦(云0001)、双江铁壳麦(1) (云0008)、双江长芒铁壳麦(云0016)、云县长芒硬壳麦(云0026)、龙陵顶芒大河头小麦(云0005)、双江铁壳麦(6) (云0012)、凤庆白壳光头铁壳麦(云0021)和云县铁壳麦(4) (云0024)等9份材料被分在第一组，说明这8份云南小麦、尤其是腾冲铁壳麦(云0001)和中国春的遗传关系最近。第二组包括镇康顶芒铁壳麦(1) (云0033)、永德顶芒铁壳麦-1 (云0040)和永德顶芒铁壳麦(1) (云0047)等14份。第三组包括双江铁壳麦(8) (云0013)、双江铁壳麦(云0015)和双江铁壳麦(云0007)等13份。

图4 基于8对SSR引物的47份材料的遗传聚类图 注: 1~47: 为47份参试材料的序号(表2) Figure 4 Genetic clustering chart of 47 materials bass on 8 SSR primer Note: 1~47: The number of 47 accessions materials (table 2)

2讨论
虽然宋星(宋星, 2006, 中国农业大学, pp.1-42)和Watanabe等(2005)分别筛选出了和西藏小麦断穗基因有一定联系的SSR引物GDM8和GDM72，但是这两对引物和Br1的连锁关系较弱，可能不适宜用作检测小麦断穗基因的SSR分子标记。所以，没有在大多数云南小麦中发现有GDM8或GDM72扩增出的迁移率一致的条带。同样，也因为已报道的WMS-32、WMS72等引物和断穗基因Br2、Br3、Br^t、、Br⁶¹之间的连锁关系，也没有在多数云南小麦中发现引物WMS32和WMS72等扩增出的位置相同的条带。

除双江长芒铁壳麦(云0017)外，引物GDM72扩增到的云南小麦的条带较中国春的大有22份，11份的条带和中国春的相当，3份的条带较中国春的小(图1)。根据刘亚西(2005)利用GDM72扩增西藏半野生小麦AS9053和中国春小麦3DS，得到的AS9053的条带较中国春的条带小的结果，证明云南小麦和西藏小麦AS9053在位点xgdm72-3DS或Br基因上是有差异的。因为AS9053恰好是Chen等(1998)用于定位西藏小麦断穗基因Br1的材料。另外，这个引物对陕西粗山羊草扩增出的条带只和3份云南小麦的条带相当，而扩增出的中东粗山羊草的条带和1份云南小麦(凤庆白壳光头铁壳麦, 云0021)的条带相当，说明云南小麦和2份粗山羊草在xgdm72-3DS位点也有较大的差异。

本研究聚类分析的结果也许从另一角度支持了中国杂草型节节麦很可能是由伊朗或中东地区的野生型节节麦经丝绸之路传入中国中原地区(魏会廷等, 2008, 自然科学进展, 18(9): 987-993)和中国杂草型节节麦可能没有参与中国普通小麦的起源(王海燕等, 2005; 刘登才和房洪, 2003; 蔡华等, 2006)的观点，也可能为云南小麦和中国春在核型及带型上没有较大差别(吕萍和张自立, 1983, 遗传, 5(4): 20-22)的结果提供了一些分生物学上的证据。但是应当指出，在37份云南小麦亚种中只有8份和中国春划分在同一组，说明云南小麦亚种内部可能已有明显的遗传分化，并且只有少部分和中国春的进化水平相当或类似。还应当指出的是，由于本研究选用的SSR引物与目标基因的连锁关系及植物材料的原因，可能导致分析会有偏差。因此，有必要在今后的研究中首先对云南小麦的断穗基因进行精确定位，筛选出和目标基因紧密连锁的标记并增加更多的粗山羊草、野生二粒小麦等材料，开展更深入地研究，才能较准确地揭示云南小麦亚种和普通小麦的祖先、西藏小麦、马卡小麦和斯卑尔脱小麦等稀有小麦种或亚种的遗传亲缘关系。

3材料与方法
3.1植物材料与SSR引物
本研究所用的37份云南小麦和中国春均来自云南省作物种质中期库，另外9份材料由中国农业科学院作物科学研究所李秀全老师提供(表2)。所有材料的新鲜、无病斑幼嫩叶采自本所试验地。选用的8对SSR引物(表1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成，其序列来自http://wheat.pw.usda.gov/。10×Buffer (含Mg²⁺浓度18 mmol/L)、dNTP和Taq DNA聚合酶则购自TaKaRa。

表2 47份参试材料 Table 2 The cultivar of 47 accessions

3.2 DNA提取及SSR扩增与电泳
首先，按照改良的CTAB法(夏铭等, 1999; 柴建芳等, 2006)提取所有参试材料幼嫩叶的全基因组DNA，并配制成待用的DNA样品。然后，在事先优化(周国雁等, 2012)的总体积为25 μL的反应体系(包括有Taq DNA聚合酶1.5 U, SSR引物0.14 μmol/L, dNTP 0.25 mmol/L, Mg²⁺ 1.8 mmol/L和30 ng的模板DNA, 并用ddH₂O补足至25 μL)中用T-Gradiant (Biometra, 德国) PCR仪扩增目标DNA。其扩增条件为94℃预变性3 min，44个循环；按照94℃变性1 min，50℃复性1 min，72℃延伸2 min，最后72℃延伸10 min，于4℃保存。扩增结束后，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，并在0.5×TBE的电泳缓冲液和紫外透射仪下观察扩增结果，最后照相记录电泳信息。

3.3数据处理
根据同一引物在所有材料中扩增出的片段与标准DNA分子量的相对迁移位置，按照其分子量由大至小或所处位置由高至低的次序，将所有材料划分成1、2、3、4…等不同的组。在同组材料中将有条带的都记为1，无带或条带不清晰则被记为0。然后，按带型分别读取所有材料的条带信息，建立0、1数据矩阵。按照PIC=1-∑P_t²和I=-∑P_ilnP_i分别计算各SSR位点的多态性信息含量和Shannon多样性指数。式中P_i为某个SSR位点在第i组等位基因或条带出现的频率。采用NTSYS PC-2.1e软件统计分析各参试材料之间的遗传距离，并按SAHN (sequential agglomerative hierarical nested cluster analysis)方法和非加权成对群算术平均数方法(unweighted pair-group method with arithmetic average, UPGMA)构建遗传聚类树形图。

作者贡献
周国雁是本研究的实验设计、数据分析者与论文初稿撰写者；李文春参与了本研究的实验设计，是实验研究的具体执行人；汤翠凤参与了实验设计讨论；伍少云是项目研究的构思者及负责人，并指导实验方案的设计、数据分析与论文描写，负责本文的修改。全体作者都阅读并同意最终的此文本。

致谢
本研究由云南省科技厅项目(2010BB005)和云南省农业科学院专项共同资助。感谢中国农业科学院作物科学研究所李秀全老师提供了本项研究的部分种质资源材料。

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